丁基疏水色谱柱是一款以丁基键合无孔型亲水性聚合物基质为填充剂的疏水作用色谱柱。其填料材料通常采用具有丁烷基疏水性质的有机硅，这种材料既具有良好的化学稳定性，又能有效地保持化合物分子的亲疏水平衡。此外，也有以粒径为2.5微米的丁基键合无孔型亲水性聚合物基质为填充剂的疏水色谱柱，如TSKgel Butyl-NPR色谱柱。
丁基疏水色谱柱的分离机理与反相色谱基本相同，都是利用溶质与固定相间的疏水相互作用实现分离。不同的是，其固定相的疏水性不如反相固定相强，多为低密度分布的甲基、乙基、丙基、丁基和苯基等。在高浓度盐溶液中，亲水性较强的物质分子内部的疏水基团外露，可与疏水的固定相以疏水作用力相结合（吸附）。由于这种作用力大小不同，可以通过改变极性流动相的离子强度（由高到低）使其依次解吸附，从而实现分离。
1、样品预处理
去除杂质：在使用之前，需要对样品进行适当的预处理，去除其中的杂质。杂质可能会干扰分离过程，导致峰形拖尾或分离效果不佳。可以使用过滤、离心等方法去除样品中的颗粒物和沉淀，也可以使用萃取、吸附等方法去除样品中的杂质分子。
调整pH值：样品的pH值对丁基疏水色谱柱的分离效果有重要影响。一般来说，在中性或弱酸性的条件下，丁基疏水柱能够更好地保持其亲疏水平衡，从而实现更高效的分离。因此，在进样前，需要根据样品的性质和分离要求，选择合适的缓冲液来调整样品的pH值。
调整离子强度：离子强度也会影响样品与色谱柱填料之间的疏水相互作用。适当降低样品的离子强度，可以增强疏水相互作用，提高分离效果。可以通过稀释样品、使用低浓度的缓冲液等方法来调整样品的离子强度。
2、色谱柱的选择与连接
选择合适规格：根据样品的复杂程度、分析目的和实验室条件等因素，选择合适的色谱柱。例如，对于复杂样品的分离，可以选择较长、内径较小的色谱柱；对于快速分析，可以选择较短、内径较大的色谱柱。
正确连接色谱柱：将色谱柱入口端连接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头标明正确流向。当溶剂均匀地从柱出口端流出时，再将色谱柱出口端接到系统检测器上，这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡。
3、流动相的选择与优化
选择合适的有机溶剂：通常使用含有有机溶剂（如乙腈、异丙醇）的缓冲液作为流动相，以促进生物大分子与色谱柱填料的疏水相互作用。不同的有机溶剂对分离效果有不同的影响，需要根据样品的性质和分离要求选择合适的有机溶剂及其比例。
控制流动相的pH值：流动相的pH值会影响样品和色谱柱填料的电荷状态，从而影响疏水相互作用。在选择流动相的pH值时，需要考虑样品的稳定性和溶解性，以及色谱柱的适用范围。
优化流动相的组成：通过调整流动相中不同组分的比例，可以优化分离效果。例如，增加有机溶剂的比例可以增强疏水相互作用，但过高的比例可能会导致样品在色谱柱上的保留时间过长；增加缓冲盐的浓度可以调节样品的电荷状态，但过高的浓度可能会导致盐析现象。
4、流速和压力的控制
控制流速：在使用色谱柱时，需要注意控制流速。过高的流速可能会导致柱子破裂或分离效果不佳，而过低的流速则会延长分析时间。一般来说，可以根据色谱柱的内径和长度，以及样品的复杂程度等因素，选择合适的流速。
监测压力：在分离过程中，需要实时监测色谱柱的压力。如果压力过高，可能是由于流速过快、样品过载或色谱柱堵塞等原因引起的。此时需要及时调整操作参数，降低压力，以避免对色谱柱造成损坏。
5、分离条件的优化
梯度洗脱：对于复杂的样品，可以采用梯度洗脱的方法来提高分离效果。梯度洗脱是指在分离过程中，逐渐改变流动相的组成或pH值，使不同的组分在不同的时间被洗脱出来。通过优化梯度洗脱的程序，可以实现更好的分离效果。
温度控制：温度对疏水相互作用有一定的影响。适当提高温度可以增强疏水相互作用，但过高的温度可能会导致样品变性或色谱柱的性能下降。因此，在进行丁基疏水色谱分析时，可以根据需要选择合适的温度。
6、色谱柱的维护与保养
定期清洗：使用新鲜洁净的水与乙腈冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。每次使用完色谱柱后，应及时用纯水或适当的溶剂清洗色谱柱，去除残留的样品和杂质。
避免碰撞：取用色谱柱时避免磕碰掉落，以免损坏色谱柱的填料和结构。
长期保存：如果长时间不使用色谱柱，应将其保存在合适的条件下，避免污染和损坏。可以将色谱柱保存在纯水或适当的溶剂中，并放置在阴凉、干燥的地方。
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