TSK凝胶色谱柱是一种高性能的色谱柱,其工作原理主要基于成分分子大小、电荷和亲水性的差异。当混合物通过色谱柱时,较小的分子可以进入凝胶颗粒内部的孔隙中,而较大的分子则只能在颗粒外部流动。因此,具有较小分子量或较大电荷的分子会首先从凝胶层中通过,而具有较大分子量或较小电荷的分子则需要更长时间才能通过,从而实现混合物中不同分子的分离。
1、溶胀:商品凝胶通常是干燥的颗粒,需要在使用前在洗脱液中充分溶胀一至数天。如果在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸,则溶胀时间可以缩短到1~2小时。溶胀必须完q,否则会导致色谱柱的不均匀。
2、装柱:由于凝胶的分离是靠筛分作用,所以凝胶的填充要求很高,必须要使整个填充柱非常均匀。在装柱前,可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质,并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱,在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定,加入少量流动相以排除柱中底端的气泡,在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗,颈直径约为柱颈的一半,然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液,同时打开色谱柱的毛细管出口,维持适当的流速,凝胶颗粒将逐层水平式上升,在柱中均匀地沉积,直到所需高度位置。最后拆除漏斗,用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面,再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查:凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀,在对样品进行分离之前,对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的,检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯,用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等,加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围,如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整,即说明色谱柱性能良好;如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样:凝胶柱装好后,一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理,才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素,总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱,一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些,但如果样品的溶解度与温度有关时,必须将样品适当稀释,并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后,这时可打开色谱柱的。