尺寸排阻色谱柱（SEC）是液相色谱中专门用于按分子尺寸差异进行分离的核心分析工具。与其他依赖极性、电荷或疏水性相互作用的色谱柱不同，它完q依靠物理“分子筛效应”实现分离，过程温和，不会破坏样品的天然结构。
在工作原理上，色谱柱内部填充了带有特定孔径的多孔微球填料。当样品随流动相流经色谱柱时，不同大小的分子会经历不同的路径：大分子因无法进入填料微孔，仅在颗粒间隙中流动，路径最短，从而最先被洗脱；中等分子可部分进入孔隙，洗脱时间居中；而小分子能够深入大量微孔，流动路径最长，最后被洗脱。因此，洗脱顺序严格遵循从大到小的规律。
尺寸排阻色谱柱的操作方法：
一、开机前准备
流动相预处理：将选定的流动相用0.22μm滤膜过滤，超声脱气15~30分钟，去除流动相中的杂质和气泡，避免堵塞色谱柱。
系统预冲洗：先将色谱柱从系统中拆下，用超纯水冲洗液相系统管路，置换管路内的残留盐溶液，防止盐析出损伤色谱柱。
柱温箱预热：提前开启柱温箱，将温度设置为实验所需的恒定温度，待温度稳定后再安装色谱柱。
二、色谱柱安装与平衡
正确安装柱体：按照色谱柱上标注的流动方向标识连接进样端和检测端，连接时避免过度拧紧接头，防止漏液或损坏柱筛板。
低流速预冲洗：以0.2~0.3mL/min的低流速启动泵，逐步置换柱内的保存溶剂，过渡到实验所用的流动相。
充分平衡柱体：将流速逐步提升至实验设定值，持续冲洗色谱柱至少10~20倍柱体积，直至基线完q平稳，确认柱压稳定在正常区间。
三、样品分析操作
样品预处理：将待分析样品用0.22μm滤膜过滤，去除样品中的大颗粒杂质，避免杂质堵塞柱入口筛板。
进样参数设置：设置合适的进样量，常规分析进样体积控制在10~50μL，避免进样量过载导致色谱峰形变差。
序列进样检测：按照从低浓度到高浓度的顺序进样，每进完几个样品后，插入一针空白流动相冲洗，减少样品交叉污染。
四、实验结束后冲洗与保存
梯度冲洗柱体：分析完成后，用不含盐的流动相逐步置换柱内的含盐缓冲液，冲洗至少15倍柱体积，完q去除柱内残留的盐类。
保存溶剂置换：根据色谱柱填料类型，用规定的保存溶剂（如甲醇、乙腈或高纯水）冲洗柱体，置换完q后将柱两端用密封堵头拧紧。
规范存放：将色谱柱从系统中拆下，竖直放置在常温干燥的环境中保存，避免阳光直射和剧烈碰撞。
五、关键操作禁忌
严禁使用纯水长时间冲洗有机相体系的尺寸排阻色谱柱，避免硅胶基填料水解损坏。
操作过程中严禁流速骤升骤降，避免产生过大的柱压冲击，导致填料床层塌陷。
禁止使用强极性、强腐蚀性的非常规溶剂，避免溶解填料或破坏柱体结构。
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