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轻松掌握C18反相色谱柱:简单步骤让你快速上手!

更新时间:2024-10-28浏览:166次
  C18反相色谱柱是一种高效液相色谱柱,在药物分析、环境监测、食品安全检测等领域有着广泛的应用。利用反相色谱技术,其原理是表面修饰成疏水性的碳链(C18链)与待测物通过疏水作用相互作用,实现对待测物的分离和纯化。具体来说,C18反相色谱柱内部填充有一定大小和形态的颗粒,表面涂层有一层碳链和疏水基团。样品在经过样品预处理后,通过进样器注入色谱柱中,在柱内填充的颗粒表面发生反相作用,非极性物质向柱内靠拢,极性物质则排斥柱内颗粒而向外逸散。通过改变流动相的极性和离子强度等条件,可以实现对待测物的选择性分离和纯化。
  C18反相色谱柱其操作步骤:
  1、准备工作:
  检查仪器设备是否正常运行,确保柱子处于良好状态。准备好所需的溶剂和移动相。
  新柱在使用前需进行处理。配制好65%的乙腈/水溶液,将色谱柱正确连接在色谱仪上,出口放空(注意出口端不可连上检测器,以免污染),以低流速0.1ml/min~0.5ml/min进行冲洗,等看见柱子出口有液体流出后,过20分钟再接上检测器,以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min,继续冲洗2~8小时。
  2、样品制备:
  将待测样品溶解于适当的溶剂中,并进行必要的预处理,如过滤、离心等。
  3、柱子装填:
  将C18反相柱装入色谱柱架中,连接好进样系统和检测器。
  4、初始条件设置:
  设置移动相组成和流速,一般采用梯度洗脱方法,即开始时使用较弱的极性溶剂,逐渐改变为较强的极性溶剂。
  5、进样:
  将样品通过进样系统注入柱中,注意保持稳定的进样流速。
  6、色谱分离:
  开始进行色谱分离,根据需求调整流速和梯度条件,使不同组分得到有效分离。
  7、数据采集和解析:
  利用检测器对柱出口的化合物进行检测和记录,获取相应的色谱图。
  8、结果分析:
  根据色谱图进行结果分析,确定目标化合物的峰位置、峰高、峰面积等参数。
  9、色谱柱清洗:
  如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相,做完样品后可直接用55%~65%乙腈/水或55%~65%甲醇/水冲洗色谱柱40~80分钟,然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存。
  如果样品分析中流动相里含有缓冲液或酸或离子对试剂,做完样品后需先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水冲洗一小时以上(如果色谱柱更长,则还需增加适当时间),然后用55%甲醇/~水65%/水冲洗色谱柱30~60分钟,最后用甲醇或乙腈以1ml/min流速冲洗30分钟。
  10、色谱柱再生:
  当色谱柱使用较长时间后出现柱压力升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等情况时,可进行再生。先用5%甲醇/水或5%乙腈/水反向冲洗60分钟以上,然后用四氢呋喃以1ml/min流速冲洗30分钟以上,再用65%甲醇/水或65%乙腈/水以1ml/min流速冲洗60分钟,最后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存即可。
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