服务热线:
021-34610856
技术支持

您现在的位置:首页  >  技术文章  >  SEC-MALS:让腺相关病毒 (AAV) 表征更上一层楼

SEC-MALS:让腺相关病毒 (AAV) 表征更上一层楼

更新时间:2023-03-02浏览:1014次

文/Tosoh Bioscience应用科学家Heidi Vitrac, Ph.D.


前言

新冠疫情把病毒变成了每个人共同的一段切身经历,尽管如此,我们仍需记住,并非所有的病毒都是危险的。事实上,一些病毒能够起到输送生物治疗剂的作用。在进行基因治疗时常会用到这项技术,可以通过修改患者基因达到治疗或治愈疾病的效果。基因治疗主要分为以下几种方式:通过专业技术人员实现正常基因的拷贝与致病基因的替换,使功能异常基因失活,或向体内引入新基因或修饰基因。

选择方案三时,病毒载体——特别是使用AAV的病毒载体,可以说是极为有用。首先,由于其固有的自然设计,病毒载体进入细胞的效率非常高。其次,该病毒载体的复制需依赖于与其他病毒的共感染,这点使其不具有致病性。最后,至少有12不同人血清型AAV,其各自感染的细胞类型不同,使其可用于靶向特定类型细胞的治疗。

AAV载体是由蛋白质和DNA组成的有着精确构造的复杂生物分子组合。理想情况下,科学家可以造出含预期单链DNA的细胞衣壳。但是,系统存在产生无任何DNA的空衣壳及部分填充的衣壳的风险,这些不良衣壳可能会导致治疗无效或疗效降低。因此,开发生产及测量AAV衣壳的可靠方法

是非常需要的,包括但不限于测量DNA属性(如基因组完整性、AAV DNA修饰和衣壳中存在的部分DNA)以及衣壳自身属性(如衣壳的特性、病毒蛋白占比、聚集体等)。这正是SECMALS可以发挥作用的地方,特别是在给药试验中基因组滴度测定及聚集体或空壳、部分和完整AAV测定方面。


SEC-MALS的威力

要了解SEC-MALS法的威力,首先要了解光散射分析的优势和过程。光束照射到溶液中的分子时,分子内会产生振荡偶极子,此时光会向各个方向重新射出。一般来说,光的射出量与分子量有关;但是,散射光的强度随其散射方向不同而有所差异。为了收集到非常精确的分子测量数据,应从多个不同角度来测量散射光。

东曹生命科学的LenS3 MALS检测器从极小角度(10度)、极大角度(170度)和直角,三角度散射光检测模式,来计算分子大小。根据分子是大还是小,可以调用不同的角度。检测器单次运行即可获得三个关键质量属性的量化数据:颗粒浓度、衣壳含量和聚集度。典型的仪器配置如图1所示。事实上,该方法的主要优势是其所需的系统改造最小也很简单。



分析高分子量的AAV时,首先必须选择合适的东曹TSKgel® SEC色谱柱才能获得分析和鉴定各种杂质所需的合适分离度(图2)。

然后,可以根据具体分析和需求进行深入优化或微调。最后,SEC-MALS从三个方面为AAV表征提供最有力的方法支持:使用LenS3实现超高灵敏度,测定完整/空壳比率时的增强准确度,及测定AAV聚集体和杂质的能力。



灵敏度和准确度

总的来说,相较于传统UV检测,LenS3检测的灵敏度优势明显(图3)。与UV260和UV280检测相比,MALS法的灵敏度明显更高,特别是检测AAV时,由于这些病毒的分子量相当大,因此其后续在MALS中的光散射信号响应十分强。事实上,如果所选的色谱柱适当,即使浓度极低,如每毫米粒子数仅为4×109,也可以使用MALS实现检测。另外,研究表明,直角光散射(RALS)信号和衣壳含量在较大的浓度范围内呈明显的线性相关,这为颗粒定量测定置信度提供了保证。



制备AAV时一般会产生三类衣壳:空衣壳(不含单链DNA)、部分衣壳(含完整长度基因组DNA的片段)和完整衣壳(含所需基因组材料的完整长度)。由于所需产品是完整的AAV衣壳,因此测定完整/空衣壳占比是一个关键的质量属性要求。目前,SEC-MALS法尚且无法区分完整衣壳和部分衣壳,仅可区分完整衣壳和空衣壳。

好消息是,同样的SEC-MALS法测定分子量的能力十分强大,也可用于测定AAV衣壳的DNA含量。如图4所示,将RALS信号强度与预期百分比数据进行比较,研究人员发现RALS信号与衣壳DNA含量之间呈明显的线性相关。简而言之,该方法能够精准预测分子量,将制剂中空衣壳含量降低至2%左右。

SEC-MALS法的灵敏度、准确度和精密度明显优于280 nm260 nmUV检测法,这要归功于科学家能够制备出更高密度完整衣壳混合物样品,从而产生更强的信号响应。

利用MALS还可以最大限度地降低测定DNA时的不准确度。随着细胞内DNA含量的增加,细胞本身变得更加坚实,细胞内能量减少的检测也变得更加容易。这些附加数据的获取能够增加测定完整空衣壳比率的置信度。本质上讲,SEC-MALS法更容易识别蛋白质的聚集体和片段,同样归功于LenS3检测器具有出色的灵敏度。




未来应用

AAV下游工艺的主要挑战之一是有效分离所需的完整AAV与纯化后的残留杂质。如果将SEC-MALS法用于未纯化样品,能否应对这一挑战?

结果显示,大部分杂质可通过较高的UV响应(如:UV@280 nm16分钟内)检测出来。但UV检测法对于完整的AAV并不适用。事实上,由于密度问题,14.5分钟左右时仍未检测到AAV衣壳的UV信号。这也是SEC-MALS法发挥作用的地方,它能够检测和定量具有复杂基质的样品。简而言之,SEC-MALS法为分析各种血清型的AAV提供了高灵敏度、稳健的工具。这一论断对生产和质量控制两个阶段都适用。

SEC-MALS也可用于分析AAV以外的其他病毒。科学家总能想出新的基因递送策略,东曹生命科学也总有相应策略与之应对。对小病毒颗粒研究得出了与AAV的试验相似的结果,并实现了高效分离。东曹生命科学对这些病毒颗粒进行了高效分离和分子量测定,通过质量单位与能量换算得出12.8纳米的结果——与该病毒颗粒的报告值匹配。简而言之,SEC-MALS法不仅可应用于AAV,也为其他各种应用创造了无限可能。










东曹(上海)生物科技有限公司 版权所有    备案号:

技术支持:化工仪器网    管理登陆    网站地图

咨询热线:
021-34610856

微信服务号