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详谈反相色谱柱的原理

更新时间:2019-09-05浏览:6058次
       根据流动相和固定相相对极性不同,液相色谱分为正相色谱和反相色谱柱。流动相极性大于固定相极性的情况,称为反相色谱柱。非极性键合相色谱可作反相色谱柱。在现代液相色谱中应用醉广泛,现代液相色谱分析工作的70%以上是在非极性键合固定相上进行的。
  反相色谱柱是指利用非极性的反相介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流动相,根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与HIC一样,RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面*被非极性基团所覆盖,表现出强烈的疏水性。因此,必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。
  溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性,一般疏水性越大,分配系数越大。当固定相一定时,可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。RPC主要应用于相对分子质量低于5000,特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化,也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性,并且流动相为低极性的有机溶剂,生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活,所以,以回收生物活性蛋白质为目的时,应注意选用适宜的反相介质。
  反相介质的商品种类繁多,其中醉具代表性的是以硅胶为载体,通过表面键合非极性分子层制备。通过控制反应时间和温度,可获得性能稳定的反相介质。在硅胶基质的反相填料中,以键合有C18、C8、C2的球形多孔填料醉为常见,用途醉广。
  RPC固定相大多是硅胶表面键合疏水基团,基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。在生物大分子分离中,多采用离子强度较低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。
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