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离子交换色谱的原理和实际操作

发布时间:2017-09-12浏览:998次
离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法,其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合,这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的,在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时,离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同,其与离子交换剂的结合能力也不同,所以被洗脱到溶液中的顺序也不同,从而被分离出来。

绝大多数重组蛋白纯化都要用到离子交换。离子交换色谱的基础是高分辨率,可以直接放大规模应用在工业上,柱再生容易,还可以使蛋白浓缩。大多数蛋白质的静电荷是负值,因此阴离子交换色谱的应用zui为广泛。

离子交换色谱的实际操作:

1.将超纯水与沉降胶按1:3比例悬浮,轻轻搅匀;
2.将色谱柱固定到设备支架上,链接出口管道,从柱底端进口反向泵入超纯水,排除管道及筛板中的气泡,停泵,然后从出口端放出部分超纯水,保留1~2cm高度超纯水,封死出口端,然后正向冲洗进口端管道和适配器,排除筛板和管道中气泡;
3.通过玻璃棒引流将悬浮胶导入色谱柱,在柱上端补充部分超纯水,搅匀,装上适配器;
4.将柱出口端与色谱设备连接,以0.2MPa恒压装柱,装填至恒定的柱床高度,标记柱床胶面位置,关闭泵,松开适配器,降低适配器至胶面下2mm处,继续装填,待柱床高度稳定后,标记柱床胶面位置,降低适配器至柱上标记柱床位置下2mm。固定适配器,继续装填2~3柱体积;
5.确定柱体积,测量柱高,计算柱体积及记录装柱时的zui大流速;
6.选择zui佳线速,用0.5mol/L NaOH冲洗柱,冲洗3~5体积;
7.接着用超纯水冲柱,冲洗10柱体积,至pH显示接近超纯水pH。
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